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眼表细胞学检查

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2016-10-08 11:14
标签:细胞  染色  结膜  细胞学  标本  

导读:

眼表疾病,无论是感染或炎症,都会改变眼表细胞的成分和形态。从眼表收集的标本,通过光镜或组织化学染色,能够显示疾病的特征,有助于疾病的诊断。他别是今年来发展的眼表印迹细胞学,具有很高的临床诊疗价值。

关键词:

眼表细胞学(Ocular surface cytology);微生物(microorganism);印迹细胞学(impression cytology);杯状细胞(goblet cells)

许多感染和炎症性疾病可通过结膜或角膜标本的光学显微镜细胞学检查来协助诊断。标准染色过程被广泛用于检察微生物和患者本人的细胞。

标本采集:

老式的结膜刮片通常是用拭子收集表面渗出物,获得结膜标本来做细胞学检查。医生先用表面麻醉剂滴眼并翻转上睑,以消毒铲轻轻刮上睑结膜,当上皮细胞被获取以后,结膜表面变白,要避免过多出血。

理想的拭子收集标本用于微生物培养,应在滴表麻药以前从结膜表面获取标本。藻酸钙、棉花、聚酯拭子都能用来收集角膜和结膜表面的上皮细胞或微生物菌落。与此同时,也可以从对侧眼获取标本作为对照。

表2-1眼表细胞学的临床解读

发现                  举例

多形核白细胞占优势           细菌性结膜炎

                    早期严重性病毒性结膜炎

                    严重过敏或特发性结膜炎

淋巴和单核白细胞占优势         病毒性结膜炎

                    慢性中毒或过敏性结膜炎

嗜伊红白细胞              急性过敏性结膜炎

                    寄生虫性结膜炎

嗜碱性白细胞或肥大细胞         春季结膜炎

浆细胞和巨噬细胞            衣原体性结膜炎

多核细胞                单疱性眼睑结膜炎

角化上皮细胞              泪液功能不全状态

                    类天疱疮

                    Stevens-Johnson综合征

胞浆包涵体               衣原体性结膜炎

眼表细胞学解读

1.微生物

革兰氏染色帮助确认微生物和辅助细菌分类;Giemsa染色用于评估细胞特征和在上皮

细胞、大多数细菌、真菌、衣原体。吖啶橙(acridine orange)和钙荧光白(calcofluor white)是化学荧光染色,需在荧光显微镜下检查。吖啶橙将绝大多数细菌在深色背景下染成橙色,而和荧光增白剂造成真菌和棘阿米巴包囊显现绿色荧光;抗酸染色帮助鉴别丝状细菌。所有涂片在染色以前,必须先经甲醇或其他固定液中固定。

2.人体细胞

一种以美蓝为基础的染料诸如Giemsa或Wright染色对确认下述细胞类型特殊的细胞形态特征极为有用:正常结膜和角膜上皮细胞比白细胞略大,上皮细胞有一个居中的圆形细胞核(有时核仁显著),胞浆均匀(图4-2)。通常扁平,当涂片于玻片时,鳞形上皮细胞看起来像立方形,倾向于在膜上聚集成堆。

表2-2眼表细胞学染色过程

革兰氏染色

结晶紫浸没玻璃片1分钟,自来水缓缓流水冲洗;

革兰氏碘漂洗1分钟;

倾斜玻片,允许整个玻片溶剂脱色,直至紫色被漂洗干净;

藏红溶液1分钟,漂洗至污渍变干;

用光镜油镜头检查,革兰氏阳性球菌和杆菌被染成蓝紫色, 革兰氏阴性细菌被染成粉红色。

Giemsa染色

用新鲜配置的Giemsa染色溶液浸没玻片1分钟;

甲醇漂洗至污渍变干;

光镜检查,白细胞有熏衣草胞浆和紫色核仁;多形核细胞颗粒染成粉紫红;嗜伊红颗粒染成亮丽紫红色;衣原体包涵体、细菌、真菌被染成蓝紫色。

吖啶橙染色

用酸性吖啶橙染料着染玻片2分钟;

漂洗至污渍变干;

在荧光显微镜下检查,细菌和阿米巴一般被染成橙色,组织细胞和真菌被染成绿色。

钙荧光白染色

用几滴钙荧光白-Evans蓝溶液盖没;

在荧光显微镜下检查,真菌和阿米巴包囊在深红背景下被染成绿色。

抗酸染色

以石炭酸品红液浸没玻片5分钟,自来水淋洗;

用酸酒精脱色;

孔雀石绿溶液5分钟,淋洗;

光镜下检查,绝大多数分支杆菌和诺卡尔放线菌被染成红色。

图2-1 正常结膜上皮细胞(Giemsa×400)

图2-2 变性的上皮细胞(Giemsa×1000)

杯状细胞

结膜杯状细胞在细胞膜的边缘含有一丛苍白染色黏液取代胞浆。杯状细胞可单个或成群出现。PAS染色可将粘蛋白成分染成品红色。

图2-3 结膜杯状细胞(Giemsa×1000) 

中性白细胞

像其他粒性白细胞一样,它由骨髓中的早幼粒细胞衍生。中性白细胞系多形核,细胞核常常被分隔成窄股组成的小叶(图4-4)。欠成熟的中性白细胞(带形细胞)有一个锯形核。相当于红细胞两倍大小。中性白细胞胞浆均匀,含有苍白或不着染的颗粒。在某些中毒或感染的情况下,有时能见到暗色的胞浆内颗粒。细胞内的细菌能在吞噬溶酶体内辫认。

图2-4 中性白细胞(Giemsa×400)

嗜伊红白细胞

与中性白细胞大小相仿,常常有一个嗜伊红双叶核,一律球形颗粒充满胞浆(图4-5)。

在慢性过敏情况下,完整的嗜伊红白细胞没有破裂的细胞和沙-诺晶体(Charcot-Leydencrystals)。

图2-5 嗜伊红细胞(Giemsa×1000) 

嗜碱性白细胞和肥大细胞

嗜碱性白细胞有一个带状或分叶状核,和深色胞浆内颗粒,分布、大小和形状不规则。

图2-6 嗜碱性白细胞

图2-7 肥大细胞

淋巴细胞

淋巴细胞大小各异,比较大的很成熟的细胞类似单核细胞,细胞含有单个大核和稀少的染色很淡的胞浆,有时可见散在的颗粒或空泡。淋巴细胞常常为圆形、较大,可被压迫或破裂。

图2-8 淋巴细胞

单核细胞和巨噬细胞

图2-9 单核炎症反应

那些大的深嗜碱性胞核和胞浆稀少的是淋巴细胞;有紫色大核和中等度亮蓝胞浆(箭头)者为单核细胞;右下角大而成堆的细胞为正常上皮细胞(Giemsa×1000)。

有时,大的单核细胞很难与中性白细胞和淋巴细胞区别(图4-9)。单核细胞的特征包括胞浆色淡、钝性伪足和一个脑样卷绕的核。组织细胞含有吞噬颗粒、有伪足或蓬松的胞浆边缘。大的巨噬细胞有时有点像上皮样细胞。

浆细胞

这些大的椭圆形细胞有一个偏心的核和天鹅绒般柔软的胞浆。

图2-10 浆细胞(箭头)(Giemsa×1000)

 红细胞

图2-11 红细胞

多核巨细胞

多核上皮细胞常常因为分裂过程中和分裂失败造成,但也可能来源于融合细胞的合胞体。这些多核细胞的染色特征像正常结膜上皮细胞。巨细胞产生于颗粒反应,以通过组织切片确认,但结膜刮片中罕见。

图2-12 多核上皮细胞(Giemsa×1000)

胞浆包涵体

在上皮细胞内的嗜碱性包涵体更多见于新生儿衣原体性结膜炎,涂片中至少要有1000个以上的上皮细胞才能允许寻找到衣原体性包涵体。细胞外的基本小体由于太小无法通过胞浆染色辨认,但可以在荧光显微镜下辨认。

图2-13 结膜上皮细胞内的衣原体包涵体(箭头)(Giemsa×1000)

Pananicolaous染色比Giemsa染色更容易发现嗜伊红核内包涵体。一个苍白的晕轮围绕成丛,核移位,核染色质常常成丛或沿核边缘分布。Lipschütz体分类为Ⅰ型包涵体,有时见于单疱和水痘眼睑结膜炎。没有电镜很难确认病毒性包涵体。

色素和其他物质

小的色素颗粒可见于吞噬的炎症细胞中或散在于细胞外(图2-14)。色素膜的黑色素颗粒一律球形,来自视网膜色素上皮细胞的颗粒呈椭圆形。

图2-14 涂片显示未分化细胞和胞浆黑色素颗粒.

肿瘤细胞

新生物细胞可呈现几种状态;包括畸变或多核的,细胞形状、大小多样,有分裂相。

图2-15 眼表鳞状细胞癌

高倍镜显示正常的成熟(发育不良)缺乏非典型细胞,大核不规则,核仁突出。有丝分裂和凋亡小体以及局灶性角化不良(角化珠)。短箭头=角化珠;星星=凋亡小体;长箭头=有丝分裂图。(H & E,200X)。

微生物

图2-16 葡萄球菌

图2-17 链球菌

图2-18 假单胞绿脓杆菌 

球菌、杆菌、真菌和寄生虫可用细胞学方法看到。革兰氏和吖啶橙染色有利于鉴别这些微生物的形态特征。

图2-19 角膜上皮细胞内的棘阿米巴(角膜印迹细胞)

眼表印迹细胞学

眼表印迹细胞学检查是指用醋酸纤维素滤纸从眼表面获取的眼表浅层上皮。这些细胞可以进行组织学、免疫组织化学和分子分析。细胞样本数可以有很大的不同。一般需要两到三层的细胞。印迹细胞学诊断的应用包括眼表疾病的范围广泛,记录随时间连续变化的结膜和角膜表面、对结膜鳞状上皮化生分期以及治疗效果监测。它也是一种分析眼表疾病、免疫组化染色和DNA分析的研究工具。它是非侵入性的,相对容易执行,采样区域只给病人造成轻微不适但确能获得可靠的诊断信息。能在比较短的时间内实现快速诊断。

印迹细胞学检查始于1977年Egbert等的结膜杯状细胞的研究(3)。Egbert等人首先描述了这种微创结膜杯状细胞的方法。自那时以来,该技术已被用于评估几个眼表疾病和引入对原有技术的修改,使得它在眼表疾病的认识上成为一个有价值的工具。。

印迹细胞学技术(IMPRESSION CYTOLOGY TECHNIQUE

Egbert等人用微孔滤膜采集结膜标本,然后空气干燥和染色, PAS和苏木精染色。Tseng(4)改变了标本采集方法,染色则采用PAS与Papanicolaou氏染色的组合。Maskin 和Bodé(5)开发了一种技术,使结膜上皮细胞的细胞学检查获得的印象可以通过电子显微镜研究。纯硝酸纤维素膜和生物孔(Biopore)膜装置已被用于免疫细胞化学染色。

标本采集(SPECIMEN COLLECTION

滤纸的类型和细胞采集技术取决于标本采集的目的。滤纸孔隙的大小会影响上皮细胞收集的一致性和细胞细节分辨率。用较大孔径滤纸收集细胞,则细胞的细节是不完美的。用表面活性剂处理的滤纸也减少了细胞的收集。大多数作者使用孔径0.22 μm-0.44 μm之间的滤纸。Tseng从微孔醋酸纤维素滤纸着手改进了标本采集方法,它将滤纸修剪成一方为5mm方形、另一端修剪成一个锥形端,便于采集标本和使用一把镊子夹持和传送滤纸条(图4-20)

图2-20 滤纸片微孔直径0.22-0.45µm,从中一剪为二。从眼表干燥区域采取标本,方形一侧朝向角膜缘(a)或角膜中央(b),用Goldmann压平眼压计头均匀施压眼表约5–10秒钟,再用镊子撕下滤纸,然后置于固定液(6)

采集标本时,先滴一滴表面麻醉剂,用横跨结膜或角膜缘或两者结合在一起。从该处采样,将滤纸平滑到眼球表面,用Goldmann眼压计的头部温和的加压,其光滑平整的表面允许在整张滤纸表面面积均匀施压约5–10秒钟,然后用镊子取出滤纸条。整个取材期间,务必张开眼睑,避免滤纸条被泪液沾湿非常重要,否则因滤纸浸湿泪液太多,获取眼表细胞量就会减少。取出的滤纸条立即转移到一个含有固定液的24孔培养板。

标本染色(SPECIMEN STAINING)

常规组织学染色印迹细胞学标本用巴氏染色或苏木精染色、PAS染色。滤纸标本在一个含有冰醋酸、甲醛溶液,并在1:1:20乙醇体积比固定液中固定约10分钟。24孔培养板或24孔聚四氟乙烯样品架是用来固定和染色标本的。标本在70%乙醇中复水,然后依次设置在PAS试剂,亚硫酸钠,鳃的苏木精,和Scott’s液,并以自来水每次漂洗2分钟完成每一步。其次是用95%乙醇脱水两种变化,改良橙G染色漂洗2分钟,在95%乙醇漂洗3分钟,与曙红Y染色2分钟,再在95%乙醇漂洗5–10分钟,前5分钟在无水乙醇脱水。在染色的滤纸细胞侧必须完全浸在染色液中。每次脱色或漂洗,都要下放10次或悬浮在一个大的搅拌器中而无须持续监控。最后脱色步骤之后,二甲苯是用来使滤纸透明。在安装之前,将滤纸上皮细胞朝上。完成的玻片用光学显微镜检查。

染色溶液的制备(PREPARATION OF STAINING SOLUTIONS)(6)

Gill等人所描述的每种溶液的详细制备过程:Gill苏木素的制备,相结合的用365ml蒸馏水加125ml乙二醇、1克无水苏木素、0.1克碘酸钠、8.8克的硫酸铝,和10ml冰醋酸。室温下在磁力搅拌器搅拌1小时。最终的溶液在第一次使用前,经1号Whatman滤纸过滤。Scott自来水由1克碳酸氢钠和5克硫酸镁或10克无水硫酸镁,500毫升的水结晶。该溶液的pH值为8.02,在确定细胞核的蓝色中起着重要的作用。改良橙G是10毫升橙G,10%的总的染料含量(TDC)水溶液中加490毫升95%乙醇和0.075克磷钨酸。改良的曙红Y由350ml95%酒精,125 ml无水甲醇, 10 ml冰醋酸,0.18 g亮绿SF淡黄,5毫升3% TDC水溶液,10毫升曙红Y ,20%TDC水溶液,和1克磷钨酸。

特殊的技术(SPECIAL TECHNIQUES

特殊染色技术已设计出为电子显微镜检查和免疫细胞化学的标本试样。

为电子显微镜检查,将醋酸纤维素纸试样固定在4%的磷酸盐缓冲甲醛和1%戊二醛和钌红染色,后固定在缓冲锇固定,脱水,和包埋在树脂。

免疫细胞化学染色印迹细胞学标本,常规醋酸纤维素膜造成高水平的背景染色。使用二甲苯化学清除醋酸纤维素过滤纸对细胞表面抗原的破坏。为了克服这个问题, krenzer和Freddo(7)开发明了一种收集标本的方法,将纯硝酸纤维素膜用固定剂固定,再转移到一个多聚-1赖氨酸镀膜玻片,干燥。玻片被放置在丙酮1小时连续搅拌溶解过滤膜,洗净,在自来水漂洗5分钟,并在37°C进行纤维素消化2小时,在进行免疫细胞化学染色以前去除残留的膜材料。

Thiel等(8)人用生物孔膜(Millicell-CM 0.4 µm PICM 012550, Millipore Corp, Bedford, MA, USA)为浅表性病毒感染的免疫病理诊断。生物孔膜在潮湿的状态是完全透明的,允许光镜和荧光透射显微镜作详细的细胞学检查。

显微镜检查和临床应用(MICROSCOPY AND CLINICAL APPLICATIONS

一个印迹细胞学通常只采集1–3层细胞,无需制备横切面切片。为研究表面上皮而非上皮基底层和基底膜,因此它是理想的。然而,使用多个同一地区的印迹细胞象(在体内或体外尸眼),能够展示角膜缘上皮基底细胞的形态学。与相邻的角膜和结膜细胞相比,角膜缘细胞是比较小的,更密集,并有更大的核质比。Kessing(9)最早研究了不同部位的结膜杯状细胞密度。他发现在鼻侧睑结膜是杯状细胞密度最大的部位,颞侧睑结膜、球结膜、穹窿附近和角膜缘附近球结膜依次密度减少。

图2-21 人结膜杯状细胞分布图(圆点)。请注意,腺体密度最大的鼻下方靠近泪阜处,而颞侧密度较低。角膜缘水平两侧基本无杯状细胞存在。在颞上方穹隆结膜为副泪腺所在地。

Adams(10)研究了正常人结膜不同部位粘液的印迹细胞学,用颗粒,股和无形态描述结膜不同部位的粘液无结构模式。

图2-22 用醋酸纤维素滤纸取自年轻健康成人结膜印迹细胞学标本,PAS苏木精染色,显示分泌粘蛋白的杯状细胞(粉红染色)和一些表面的细胞(淡蓝色/紫色)。

图2-23 生物孔膜收集标本结膜印迹细胞学A.暴露的球结膜标本展示杯状细胞(G)与非杯状上皮细胞(epi).之间的关系。B.下睑结膜杯状细胞密度非常高。(Giemsa染色)

印迹细胞学也被用于评估干眼、瘢痕性类天疱疮、过敏性疾病、上缘角膜结膜炎和黏多糖症、春季角结膜炎和各种疗法的效果。

Wittpenn 与Tseng等(11)根据杯状细胞存在与否、和杯状细胞密度、细胞核的形态变化、核质比、细胞质颜色变色和出现角质化,将结膜鳞状上皮化生分类为六个期。Nelson(12)则以上皮细胞形态和杯状细胞数量将结膜印迹细胞学标本分为0–3级(表4-3)

表2-3 Nelson结膜鳞状细胞化生分级

分级                表现

杯状细胞密度 >500/mm2         细胞小、圆形、核大

杯状细胞密度100-500/mm2

杯状细胞密度<100/mm2          细胞大、多角形、核小

Marner(13)研究干燥性角结膜炎患者的结膜上皮细胞印迹细胞学标本,描述在上方球结膜有一条外观蛇似的异常细胞簇核染色质(图4-23)。

Dogru等(13)用印迹细胞学展示了经过保存羊膜移植重建眼表,正常结膜上皮细胞和杯状细胞的印迹细胞学图象(图4-24)。

图2-24 单疱角膜溃疡羊膜贴敷术以前结膜印迹细胞学检查,看到角膜上少量PAS染色阳性的杯状细胞和小的圆形非分泌上皮细胞。结膜杯状细胞密度545±182/mm2

Thiel等人(8)用Biopore膜装置收集标本,应用免疫病理眼球表面的方法来诊断浅表性病毒感染,如单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、腺病毒感染。

图2-25 干燥性角结膜炎染色质印迹细胞学,结膜表面显示的蛇样染色质病变(×100,PAS染色)(14)

表2-4  Nelson结膜鳞状细胞化生分级

分级               表现

杯状细胞密度 >500/mm2          细胞小、圆形、核大

杯状细胞密度100-500/ mm2

杯状细胞密度<100/ mm2         细胞大、多角形、核小

图2-26 Gill改进的Papanicolaou染色(a–f)印迹细胞学标本(A)正常的结膜细胞学图像:圆形上皮细胞,致密的核染色和丰富的杯状细胞。(b)结膜鳞状上皮细胞化生(高核质比和双核,箭头)和杯状细胞缺乏。(c)上皮细胞(高核质比)和不同程度的角化(d)上皮细胞鳞状化生(高核质比)与不同程度的角化及核的病理改变:双核,蛇样染色质和核碎片(箭头)(E)正常上皮细胞与病理改变的杯状细胞(f)上皮细胞之间的多形核白细胞和轻度上皮细胞鳞状化生,带有黏液染色正常核的上皮细胞,没有杯状细胞(15)

图2-27 角膜缘干细胞缺乏患者角膜表面印迹细胞学呈现紫色杯状细胞(×100,PAS染色)。

结膜活检的印迹细胞学,已经成为一种眼表面鳞状细胞肿瘤形成(ocular surface squamous neoplasia,OSSN)和其他眼表肿瘤非侵入性的诊断方法。

图2-28 眼表面印迹细胞学显示不典型增生的鳞状上皮细胞:核质比增大、核深染,核膜不规则,核仁明显(×250,Papanicolaou染色)。

图2-29 左图为患者印迹细胞学标本检查展示恶性黑色素瘤细胞。右图为结膜恶性黑色素瘤的组织病理学(H&E染色, 20X).](16)

使用Biopore膜标本采集印迹细胞学,与经典的活检诊断结果之间存在80%的相关性。角化恶性肿瘤提供的假阴性率最高,原因在于印迹细胞学标本中细胞缺乏。丝裂霉素C(MMC)已获得接受治疗该肿瘤,特别是复发案例,因为广泛切除会危及角膜缘干细胞功能。McKelvie等人(17)对MMC OSSN治疗后患者,用印迹细胞学证实恶性细胞的消除,主要是通过细胞凋亡,并有少量伴随炎细胞的坏死。

图2-30 多种滴眼剂长期治疗青光眼造成的树突状(dendritiform)细胞浸润。出现在结膜印迹细胞学(波形蛋白免疫组化染色绿色,碘化丙啶红核染色,激光共聚焦显微镜;比例尺:50μm)(18)

图2-31 一位35岁女性干眼患者结膜刷细胞学(BC)(a)为治疗前结膜刷细胞学和(b)为0.05%环孢素治疗1个月后的标本。(a)基线BC样品。注意炎症细胞明显(黄色箭头)和高级别鳞状上皮化生(SM;黑色箭头)。Diff快速染色。(b)0.05%局部环孢素治疗1个月后。注意炎症细胞数量明显下降和低度的鳞状上皮化生(SM)。

图2-32 0.05%环孢素滴眼液治疗前后1个月结膜印迹细胞学标本,(A)基线标本。注意高级别鳞状上皮化生(SM)和没有任何明确的杯状细胞。白色的箭头指示结膜上皮细胞的角化。PAS)染色,×400。(b)0.05%局部环孢素治疗1个月后。SM和杯状细胞的数量急剧增加,注意明显的改善(黑色箭头)。PAS染色,放大,400。(C)基线标本。棕色的颜色表明MUC5AC染色阳性。高品位的SM和MUC5AC阳性免疫组化染色很少杯状细胞(黑色箭头)。(D)0.05%局部环孢素治疗1个月后。注意在MUC5AC阳性的杯状细胞数量显著增加(黑箭头)和MUC5AC(黄色箭头)。

 

图2-33 人结膜和角膜上皮细胞P2X7受体的表达。结膜细胞系(A),角膜细胞株(B)和眼表面印迹细胞学(C)的P2X7受体表达。细胞固定、渗透,然后用P2X7受体抗体孵育。核用碘化丙啶染色。细胞用共聚焦显微镜观察(19)

虽然印迹细胞学检查已在大量的临床和研究中应用,但它尚未成为大多数临床常规诊断工具,因为它比较繁琐,要耗费临床医生和病理学家许多时间。然而,它毕竟以最小的不适换取许多眼表疾病的诊断信息,对那些临床可疑病例提供一个方便的研究工具。我们建议专业眼科中心应开发和引进这项技术作为常规的临床实践。这是实现包括眼科医生、病理学家、微生物学家和免疫学家合作,提高团队实力必不可少的方法。

2-34a)收集的细胞在从滤纸转移到聚-L-赖氨酸包裹的玻片过程中,许多细胞已在流转丢失;或(b)标本直接在滤纸。阳性绿色染色可以看到用碘化丙啶复染的红色细胞核(×63)。

2-35 健康印迹细胞学检查,注意丰富的PAS正椭圆形杯状细胞和小圆形分泌性上皮细胞片,核质比1:11:2

2-36 重度圆锥角膜印迹细胞学标本,显示细胞粘附明显下降,孤立的上皮细胞,无杯状细胞。

2-37 结膜印迹细胞学标本一个52岁的男性严重cGVHD相关的干眼患者。(A)注意明显的鳞状化生。黑色箭头指示胞浆蛋白减少的小杯状细胞。(b)注意结膜上皮细胞炎症浸润(黑箭头)。(PAS染色,×40021

2-38 A)色素性结膜痣临床图象B)印迹细胞学显示在上皮细胞中成堆的痣细胞,胞浆内黑色素颗粒22

参考文献

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