摘要
目的 在大鼠内皮损伤的基础上,联合脂多糖(LPS)和角叉菜胶(Ca)造成大鼠体内微血栓形成,建立大鼠络脉瘀阻病症结合的动物模型,在此基础上观察通心络超微粉对大鼠络脉瘀阻的防治效应。
方法 将雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和通心络组。给予模型组大鼠持续4周蛋氨酸灌胃,引起高同型半胱氨酸血症,造成血管内皮损伤。通心络组于蛋氨酸灌胃第3周开始加服临床等效量通心络,持续7天。予以对照组等量纯水灌胃4周。4周后给予模型组和通心络组大鼠腹腔注射Ca,16 h后再腹腔注射LPS,对照组同步腹腔注射生理盐水对照处理,24 h后结束实验。
结果 ① 与正常组比较,模型组大鼠血小板计数显著减少;在注射Ca前, 活化部分凝血活酶时间(APTT)显著缩短,而在注射LPS 20 h后,APTT显著延长,纤维蛋白原(Fg)含量显著减少;镜下可见肠系膜微循环障碍,提示血管内皮功能受损,并且体内广泛微血栓形成,络脉瘀阻模型复制成功。② 通心络组大鼠血小板计数显著高于模型组;在注射Ca前, 通心络组与对照组比较,APTT显著延长,而Fg含量明显减小,在注射LPS 20 h后,APTT与对照组比较无显著差异,Fg含量与模型组比较显著增多;镜下观测肠系膜微循环较模型组有显著改善。
结论 模型组具有明显的内皮损伤及微血栓形成客观指标的改变,符合络脉瘀阻的病机特点,通心络超微粉对络脉瘀阻具有显著防治效应。
心血管疾病已成为严重危害人类健康、影响生活质量的常见病。其发生发展是一个慢性的病理过程,并且发病率逐年上升,发病年龄呈年轻化,故心血管疾病的防治受到当今医学界的广泛关注。
络病理论——医学界尘封多年的古老中医理论在心血管病的防治中彰显出重要的理论和实践价值。络病学说即“久病入络”的学术体系,萌芽于春秋战国时期的《黄帝内经》,至汉代张仲景《金匮要略》得到发展,清代叶天士的《临症指南医案》提出“久病入络”说与“久痛入络”说及其理、法、方、药,形成完整的理论体系。
血管内皮损伤是血管病变的始动和进展加重的关键因素,与络气虚滞导致各种致病因素损伤过程相一致。故本研究在内皮损伤基础上建立广泛微血栓形成模型,符合络气虚滞基础上的络脉瘀阻病理机制,迄今未见相关报道。
由于中药成分和体内作用的复杂性,加之对其作用机制、药理药效等方面的基础研究严重不足,长期以来一直阻碍着中药研制的现代化和国际化进程。因此,对中药作用及其机制的深入研究,有助于进一步阐明许多血管性疾病的病理生理机制,探讨通心络超微粉对大鼠络脉瘀阻的防治效应,具有重要的理论和临床价值。
材料和方法
动物分组和处理
将SPF 级雄性SD 大鼠(体重150~180 g)以标准颗粒饲料饲养,并随机分为对照组、模型组和通心络组。
给予模型组蛋氨酸1 g/(kg·d)灌胃,饮水中加入琥珀酰磺胺噻唑(SST)0.5 g/kg,持续4周,建立大鼠内皮损伤模型。予以对照组纯净水灌胃,饮水中不加SST。通心络组于蛋氨酸灌胃第4周开始加服临床等效量通心络0.4 g/kg,持续7天。4周后,给予模型组和通心络组腹腔注射Ca 10 mg/kg,16 h 后腹腔注射细菌LPS 0.2 mg/kg。实验中镜下观察大鼠肠系膜微循环变化,并进行血小板计数和检测凝血功能。注射LPS 24 h后颈动脉采血,检测血液流变指标及血浆NO和血管性血友病因子(vWF)水平,结束实验。
血生化指标
采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理测定vWF水平,采用硝酸还原酶法测定血浆NO,实验过程均严格按照试剂盒说明书操作。
微循环观察
注射LPS(对照组予以生理盐水注射)后20 h,观测大鼠肠系膜微循环。实验前将SD大鼠禁食12 h,用4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定于特定鼠板上,于腹腔一侧行3~4 cm切口,轻轻拉出肠系膜,置于37.0°C的恒温水浴槽内,选择适宜观察部位并固定,置于三目显微镜下观察正常肠系膜微循环血流速度及流态,并通过BI-2000 医学图像分析系统录像,采用微血管流态半定量法进行分级计分统计。
凝血指标
腹腔注射Ca/LPS前和注射LPS(对照组予以生理盐水注射)后20 h,分别行心脏采血1 ml,与3.8%枸橼酸钠按9:1混合均匀,以3000转4°C离心15 min,收集血浆,在2小时内检测凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、APTT、Fg含量。另心脏采血0.5 ml,使用1.8 mg/ml EDTA抗凝管收集血液,4℃离心15 min,收集血浆2 h内检测血小板计数(PLT)。以上均送中山大学附属第一医院检验医学部检测。
血液流变学指标
实验结束时(注射LPS/生理盐水后24h),颈动脉采血3.5 ml,与3.8%枸橼酸钠按9∶1混合均匀。设定室内温度为25~28℃,水浴温度为30℃,使用六电极测定高、低切全血比黏度(WBV)。
数据处理
检测结果以均数±标准差(X±S)表示,结果应用SPSS11.0统计软件进行One-Way ANOVA统计分析。
(末完待续)
表 1 注射角叉菜胶前各组大鼠的凝血指标检测结果(X±S,n=8)
| 分组 |
PT(s) |
APTT(s) |
TT(s) |
Fg (g/L) |
| 对照组 |
8.65±0.298 |
21.30±1.576 |
54.413±5.85 |
92.373±0.265 |
| 模型组 |
8.541±0.212 |
19.643±1.053* |
55.928±6.05 |
82.116±0.472 |
| 通心络组 |
9.55±1.596 |
23.588±1.549**## |
54.039±7.597 |
1.89±0.21** |
|
PT:凝血酶原时间,APTT:活化部分凝血活酶时间,TT:凝血酶时间,Fg:纤维蛋白原。
与对照组比较:*P<0.05、**P<0.01,与模型组比较:##P<0.01(相关内容见下期)。
表 2 注射脂多糖20 h后各组大鼠的凝血指标检测结果(X±S,n=8)
| 分组 |
PT(s) |
APTT(s) |
TT(s) |
Fg (g/L) |
PLT(×10-9) |
| 对照组 |
8.56±0.298 |
21.30±1.576 |
54.413±5.859 |
2.373±0.265 |
764.12±84.13 |
| 模型组 |
9.229±0.727 |
24.129±1.765** |
51.943±6.245 |
1.869±0.243** |
442.14±67.19 ** |
| 通心络组 |
8.50±1.912 |
22.814±2.164 |
55.363±5.815 |
648.87±75.11**## |
3.008±0.556*## |
|
PT:凝血酶原时间,APTT:活化部分凝血活酶时间,TT:凝血酶时间,Fg:纤维蛋白原,PLT:血小板计数。
与对照组比较:*P<0.05、**P<0.01,与模型组比较:##P<0.01
结果
高同型半胱氨酸血症诱导血管内皮功能障碍
我们对实验大鼠采用蛋氨酸灌胃4 w,诱导高同型半胱氨酸血症。其血浆血管性血友病因子(vWF)水平显著升高,一氧化氮(NO)水平降低,内皮依赖性血管舒张功能显著降低,提示血管内皮功能受损,大鼠内皮功能障碍模型复制成功。
通心络改善大鼠凝血功能
与对照组比较(表1、表2,见4月17日C11版),模型组在注射角叉莱胶(Ca)前,活化部分凝血活酶时间(APTT)缩短,而在注射联合脂多糖(LPS)20 h后,APTT时间显著延长、纤维蛋白原(Fg)含量显著减少,血小板计数也显著小于对照组。研究提示:模型组在注射LPS 20 h后体内广泛微血栓形成,血液处于消耗性低凝状态。
通心络组与对照组比较(表1、表2,见4月17日C11版),在注射Ca前,APTT时间显著延长,而在注射LPS 20 h后,APTT时间与正常组比较无显著差异;Fg含量在注射Ca前,与对照组比较明显减少,在注射LPS 20 h后,与模型组比较显著增多,血小板计数虽仍然显著小于对照组,但显著大于模型组。研究提示:通心络可以减轻LPS 的毒性作用,有效推迟并阻止LPS 启动凝血的过程。
通心络降低全血比黏度改善肠系膜微循环
模型组全血比黏度(WBV)高、低切均显著高于对照组,而通心络组WBV高、低切虽显著高于对照组,但均显著低于模型组(表3)。
镜下可见模型组毛细血管甚至小血管阻塞,血管边缘模糊,血管周围弥漫性、片状渗血或大片瘀血,血液流态异常,颗粒感明显,呈粒缓流或粒摆流,红细胞呈中、重度聚集。通心络组观测肠系膜微循环,可见血流速度明显加快,偶见瘀血,无渗血,基本无红细胞聚集现象。采用微血管流态半定量法测定流态分级计分值(表4)。
讨论
络病与心脑血管疾病有着密切的相关性。络病的形成是由气到血、由功能病变到器质损伤的慢性病理过程,络气虚滞是这一病变的起因。络气不仅推动血液在脉络中运行,而且维持着脉络的正常功能状态。络脉是从经脉中支横别出,逐层细分的网络,络脉中运行的是血液。络脉包括现代医学从大血管依次分出的中、小血管等各级血管,更多的是指小血管和微血管。络气损伤、络脉的自稳和调节功能失常招致多种致病因素,如瘀血阻络、痰湿阻络、寒凝络脉等。络脉瘀阻是在络气虚滞的基础上发展而来的由功能性病变发展为器质性损伤的重要病程阶段,并且从小动脉、微动脉及微循环的“黏”、“稠”、“凝”、“滞”等方面考虑,因此,络脉瘀阻的动物模型应该考虑在血管内皮损伤的基础上,建立广泛的微血栓形成模型,以便更好的反映络脉瘀阻的病理变化。
血管内皮不仅具有屏障功能,而且具有重要的信息传递和内分泌功能,其中NO是血管内皮所合成分泌的最重要的血管活性物质。NO具有扩张血管,抗血小板黏附聚集,抗血管平滑肌细胞增生等作用。vWF是一种多聚糖蛋白,是血小板黏附于受损血管壁不可缺少的蛋白,可促进血小板的黏附与聚集。血管内皮细胞受损后,vWF大量释放入血,血浆vWF含量增高,促进血小板黏附与聚集,并且vWF分子量较大,其升高还可导致血液黏度增加,形成血小板血栓,促进血栓的形成。故vWF水平随内皮损伤程度的加重而增加,与血栓的形成密切相关。我们既往的研究表明,高同型半胱氨酸血症能抑制内皮依赖性的血管舒张功能,降低血浆NO水平,提高血浆vWF水平,证实高同型半胱氨酸血症造成了大鼠血管内皮损伤及功能障碍。
LPS是革兰阴性菌的主要表面成分,在血栓形成中扮演着非常重要的角色。目前注射LPS多用于复制感染性损伤模型,多给予较大剂量的静脉注射,而本试验考虑在大鼠内皮损伤基础上建立广泛微血栓形成模型,故选择诱导剂量Ca注射后,使用小剂量LPS腹腔注射,既造成炎症反应后的微血栓形成,又确保动物的存活率。结果显示,给予模型组大鼠注射LPS 20h检测凝血指标,其中APTT延长、Fg含量减小,血小板计数减少,说明由于广泛的微血栓形成造成大量凝血因子及血小板消耗,导致血液处于消耗性低凝期。血液浓缩,血液黏度增高,肠系膜微循环瘀血、血栓情况严重,可见大片瘀血及渗血,血流速度缓慢、流态异常。络脉瘀阻动物模型成功建立。
使用通心络超微粉干预该络脉瘀阻模型,可显著降低全血比黏度,保护内皮细胞,改善血液流变,还可显著增加血小板计数,在微血栓形成过程中抑制血小板聚集,减少血栓形成对血小板的消耗;在注射LPS前检测凝血指标,APTT时间较正常组延长,而Fg含量却显著减少,表明通心络超微粉可能是通过减少Fg在肝脏的合成,而具有一定的抗凝作用。其机制有待进一步探讨。在注射LPS 20 h后,APTT时间保持在正常水平,而Fg含量较模型组明显增加,提示通心络超微粉减轻了LPS 的毒性作用,有效推迟并阻止了LPS 启动凝血过程的病理生理作用,进一步证实了通心络超微粉可以有效阻止微血栓形成,起到保护血管内皮和改善微循环障碍的作用。
综上所述,建立络脉瘀阻大鼠模型,以研究通心络防治络脉瘀阻的作用,方法简单易行、结果稳定可靠,并且基本符合络病的重要病理变化“络脉瘀阻”的发生发展过程。通过通心络超微粉对该模型的干预可以看出,通心络超微粉可有效保护血管内皮,防止体内广泛微血栓形成,有效改善微循环障碍,是防治心血管疾病的有效中药制剂,对临床用药具有重要指导价值。(参考文献从略)
(叶子 整理)
表3 注射脂多糖20小时后全血比黏度结果(X±S,n=7)
| 分组 |
WBV(mPa s) |
| 比黏度高切(20s-1) |
比黏度低切(80s-1) |
| 对照组 |
3.052±0.209 |
5.209±0.375 |
| 模型组 |
5.520±0.289** |
6.992±0.296** |
| 通心络组 |
3.839±0.140** |
6.030±0.213**## |
|
WBV:全血比黏度。
与对照组比较:**P<0.01,与模型组比较:##P<0.01。
表 4 通心络超微粉对大鼠肠系膜微循环血液流态的改善(X±S)
| 分组 |
n |
1~3级 |
3~5级 |
5~7级 |
计分值 |
| 对照组 |
10 |
10 |
0 |
0 |
1.54±0.398 |
| 模型组 |
10 |
0 |
3 |
7 |
5.29±0.709** |
| 通心络组 |
10 |
4 |
6 |
0 |
3.02±0.503**## |
|
与对照组比较:**P<0.01,与模型组比较:##P<0.01。
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