中华医学会第13次全国病毒性肝炎与肝病学术会议于2007年7月5-8日在上海举行,与会代表就病毒性肝炎及其他肝病的临床和基础研究中的热点与难点问题进行了交流与讨论。
诊断病毒性肝炎的新核酸检测技术
上海复旦大学附属华山医院 施光峰
近年来,一些新的核酸检测技术逐渐运用在乙型病毒性肝炎(乙肝)和丙型病毒性肝炎(丙肝)的诊断上,下面介绍相关进展。
诊断乙肝的新核酸检测技术
血清HBV DNA实时定量检测
常用的血清HBV DNA定量检测的敏感范围为103~106拷贝/ml,而实时聚合酶链反应(PCR)HBV DNA检测的敏感范围可增至50~109拷贝数/ml。因此,实时PCR技术在诊断隐匿性乙肝方面意义重大,在检测血液捐赠者中是否存在慢性肝病的病因学诊断方面有重要的应用价值。
肝内共价闭合环状DNA检测
过去研究HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的障碍主要有两点,一是要通过肝活检获得肝组织;二是缺乏敏感、特异、定量的方法从活检组织中检测出cccDNA。
近年来,一种新的检查方法可通过两个主要步骤检测cccDNA。首先,通过脱氧核糖核酸酶降解非共价闭合环状DNA。然后,将引物定位在松弛环状DNA的断端,进行cccDNA扩增,用实时PCR技术通过标记探针定量检测病毒DNA。但是,此检查结果需通过定量检测一定数目细胞β球蛋白基因标化校正。
HBV基因型与基因序列检测
基因序列分析依然是分析病毒基因的金标准,其主要优点是可检测出新的变异株,这对服用过抗病毒药物治疗的患者检测出未知的耐药突变株特别重要。
但是,此检测方法耗时,所有相关的区域都需进行PCR扩增和基因序列分析。目前正在研究更简单的分析HBV基因序列的方法。
线性探针技术
线性探针检测技术可检测乙肝病毒的基因型、前C区变异、基本核心启动子(BCP)变异和多聚酶基因变异。其优点是即使只有5%的病毒变异,它也可以检测出来。该检查方法的特异性、可重复性和敏感性均较好。
因此,如果患者血清乙肝病毒载量开始升高,可用线性探针检测技术早期诊断病毒耐药。其缺点是只能检测已知的变异,如果要检测新的耐药变异株,需设计新的探针。
DNA芯片技术
DNA芯片技术是一种更强有力的分析HBV的基因技术。HBV DNA芯片技术可复式扩增整个HBV基因,一个高密度的HBV芯片可检测多达200个变异株的151个位点及病毒基因型。其优点是可一次分析整个HBV基因序列,缺点与线性探针技术类似,只能分析已知的病毒株,对新的病毒株需设计新的相应的芯片。
表型分析
目前表型分析方法有非载体介导和载体介导两种。非载体表型分析是PCR扩增整个HBV基因,然后将扩增产物转染人体外肝细胞,进行药敏试验。而载体介导的方法是将HBV多聚酶基因或整个HBV基因克隆至质粒载体,然后转染人细胞,进行药敏试验。这些方法可用来研究病毒对药物耐药和交叉耐药的情况。
诊断丙肝的新核酸检测技术
丙肝病毒基因型可通过直接分析5’非编码区序列进行检测,或用特定的基因型探针定位在5’非编码区,然后通过反向杂交分析方法检测。而HCV病毒载量可通过PCR定量检测。实时PCR可检测出5~30 IU/ml的HCV RNA,比经典扩增技术更快速、敏感,且无污染。
目前,丙肝治疗的终点和有效性是出现持续病毒学应答(SVR),即抗病毒治疗结束24周后,血清HCV RNA低于50 IU/ml。在不同的治疗时间点定量检测HCV RNA很重要,该检测结果既可以预测是否会出现SVR,也可以确定治疗终点。
另外,目前研究的一些新的治疗丙肝的药物(如丙肝病毒蛋白酶抑制剂)也需要快速核酸检测技术来检测出耐药的变异株。
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